线粒体分裂蛋白MiD51在HBV相关肝癌转移中的调(2)
1.2.3 免疫组化染色 首先,将保存于液氮中肝癌原发灶与转移灶组织标本进行固定、包埋与切片。65℃烤箱中烤片2 h后将切片依次置于三个二甲苯与不同浓度的无水乙醇中进行脱蜡与水化。切片用柠檬酸进行抗原修复、双氧水浸泡除去过氧化物酶与血清封闭非特异抗体处理后,即可滴加用PBS稀释好的MiD51抗体(1/300稀释)进行孵育(4℃过夜),PBS洗3次后(每次5 min)加入二抗继续孵育30 min(37℃),PBS洗3次后(每次5 min)进行二氨基联苯胺法(DAB)显色与苏木素复染(各3 min)。最后,将染色后的切片放入不同浓度的酒精与二甲苯中进行脱水处理,最后用树胶封片保存。
1.2.4 siRNA介导的MiD51表达下调 siRNA干涉片段(上海吉玛公司)序列如下,#1:5'-AGATTCCAAATGTCCTAAATCACAG-3',#2:5'-GGAATAAGA CAGTATTTAGGTTTCC-3'。无关干涉(对照组)片段序列 为 :5'-AAUACCAGAACACCAACUGGC-3'。 siRNA转染:首先,以2×105个/孔密度将HBV阳性的SNU-368细胞接种至6孔板中并培养过夜,次日进行细胞转染。采用脂质体lip2000作为介质进行细胞转染,操作步骤如下:用无血清RPMI-1640培养液分别稀释siRNA干涉片段与脂质体lip2000,将两种稀释液静置5 min后进行混合,静置30 min,将100μL的混合液加入6孔板中并置于培养箱中培养6 h。随后给细胞进行换液,培养24 h后收集细胞进行总RNA与蛋白提取、细胞划痕与Transwell侵袭实验。
1.2.5 细胞划痕实验 首先对HBV阳性肝癌SNU-368细胞中MiD51的表达进行siRNA干涉处理。细胞在6孔板中干涉处理24 h后,用移液器枪头比着直尺均匀划线,划线过程中枪头要尽量保持垂直,每孔划线3条,随后用PBS洗去划线时脱落细胞,随后置于显微镜下对细胞划痕进行拍照,细胞培养24 h后再次于显微镜下对细胞划线处进行拍照。
1.2.6 Transwell侵袭实验 首先对肝癌SNU-368细胞中MiD51表达进行siRNA干涉处理。此外,侵袭实验所用小室也需事先用基质胶进行包被。完成上述准备后即可进行如下实验操作:首先,向小室底部加入500μL含10%血清的RPMI-1640培养液,随后放入小室,加入50μL不含血清浓度为10 g/L的BSA(用无血清RPMI-1640培养液稀释),将5×104个细胞加入小室内并置于培养箱中培养48 h。用棉签擦去小室内测底面细胞(未穿膜细胞),多聚甲醛固定10 min并用结晶紫对穿膜细胞染色15 min。最后,于倒置显微镜下对侵袭至小室底部的细胞进行观察分析。
1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件对所有数据进行统计分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间两两比较采用非配对t检验,多组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MiD51在肝癌转移灶组织中表达显著上调 利用qRT-PCR与Western blot实验检测5对HBV阳性肝癌原发灶与转移灶组织中MiD51分子在mRNA与蛋白水平的表达后发现:转移灶组织中MiD51表达在mRNA与蛋白水平均明显高于原发灶组织[qRT-PCR:原发灶vs转移灶=(1.)vs(2.);Western blot:原发灶 vs转移灶=(1.)vs(3.)],差异均有统计学意义(P<0.05),见图 1。进一步用免疫组织化学染色法对另外10对HBV阳性肝癌原发灶与转移灶中MiD51的表达进行检测后发现:与qRT-PCR与Western blot实验所得结果相似,MiD51在转移灶中表达明显高于原发灶[原发灶vs转移灶=(0.)vs(0.)],差异均有统计学意义(P<0.05),见图2。
2.2 干涉MiD51可显著抑制肝癌细胞的迁移 首先,利用两条不同序列的siRNA片段对肝癌细胞中MiD51的表达进行下调,qRT-PCR与Western blot实验对两条siRNA干涉MiD51表达的效率分析后发现(图3):两条siRNA均能明显降低HBV阳性肝癌细胞SNU-368中MiD51的表达[qRT-PCR:siCtrl vs siMID51#1 vs siMID51#2=(1.)vs(0.)vs(0.25 ± 0.03),Western blot:siCtrl vs siMID51#1 vs siMID51#2=(1.)vs(0.)vs(0.)],差异均有统计学意义(P<0.05)。随后用细胞划痕实验分析干涉MiD51对SNU-368细胞迁移能力的影响,结果发现:利用siRNA下调MiD51表达可显著抑制SNU-368细胞的迁移[siCtrl vs siMID51#1 vs siMID51#2=()%vs()%vs()%],差异有统计学意义(P<0.05),见图4。
图1 肝癌原发灶与转移灶中MiD51的表达(n=5)注:A,MiD51表达的qRT-PCR检测;B,MiD51表达的Western blot检测及条带灰度扫描结果;aP<0.05。
图2 MiD51在原发灶与转移灶组织中表达的免疫组化分析(n=10)注:A,MiD51典型免疫组化染色结果(×400);B,MiD51染色强度的统计分析;aP<0.05。
图3 SNU-368细胞中MiD51干涉效率分析注:1,MiD51;2,siMiD51#1;3,siMiD51#2。A,qRT-PCR检测MiD51分子的mRNA表达;B,Western Blot检测MiD51分子的蛋白表达及条带灰度扫描结果;aP<0.05。
图4 干涉MiD51对SNU-368细胞迁移能力影响的细胞划痕实验分析(×400)注:1,MiD51;2,siMiD51#1;3,siMiD51#2;aP
文章来源:《中国微侵袭神经外科杂志》 网址: http://www.zgwqxsjwkzz.cn/qikandaodu/2020/1112/360.html