miR-515-5p通过靶向Wnt3抑制胃癌细胞增殖和侵(2)
1.2.6 双荧光素酶报告实验 通过miRDB网站( mRNA的3′-UTR处的潜在结合位点。由南京Genescript公司合成含有与miR-515-5p结合的野生型(WT)或突变(MUT)的Wnt3的3′-UTR序列,并克隆到pGL-3荧光素酶报告载体中。 将荧光素酶报告载体与miR-515-5p mimic,miR-515-5p inihibitor,对照模拟物(NC mimic)或对照抑制物(NC inhibitor)共转染MGC-803和SGC-7901细胞。 通过双荧光素酶报告基因检测系统(Promega,Madison,WI,USA)检测荧光素酶活性,将萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。
1.3 统计学方法
所有实验重复至少三次。使用SPSS 22.0(Chicago,IL,USA)或GraphPad Prism 7.0进行统计学分析。所有实验的数据表示为至少三次独立实验的采用t检验,秩和检验 (两组)和单因素方差分析(多组)进行差异分析。P<0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1 miR-515-5p在胃癌组织和细胞系中表达水平下调
我们通过qRT-PCR检测了60对胃癌及其癌旁组织中miR-515-5p的表达水平,qRT-PCR(图1A)结果显示,miR-515-5p在胃癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.0001)。此外,我们检测了4个胃癌细胞系(MGC-803,BGC-823,HGC-27,SGC-7901)中miR-515-5p的表达。qRT-PCR (图1B)结果显示,与人正常胃上皮细胞(GES1)相比,miR-515-5p在所有GC细胞系中的表达均显著降低 (P<0.0001)。这些结果表明miR-515-5p可能在胃癌中起肿瘤抑制作用。
2.2 过表达miR-515-5p抑制胃癌细胞增殖和侵袭
为了评估miR-515-5p在胃癌发展中的作用,我们分别使用miR-515-5p mimic或miR-515-5p inhibitor转染MGC-803和SGC-7901细胞,通过qRT-PCR检测转染效率,图 2A结果表明 miR-515-5p表达显著增加或减少(P<0.05),证明转染成功。CCK-8检测结果(图2B)显示,miR-515-5p可显著降低MGC-803和SGC-7901细胞增殖能力(P<0.05)。Transwell实验(图2C)表明,转染miR-515-5p mimic的胃癌细胞的侵袭能力明显低于转染阴性对照模拟物(NC mimic)的细胞(P<0.05)。这些结果表明miR-515-5p可以显著抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力。
2.3 Wnt3是miR-515-5p的直接下游靶点
为了探索miR-515-5p调控胃癌细胞增殖和侵袭的分子机制,我们使用miRDB数据库( mimic显著抑制野生型Wnt3的3′-UTR的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型的Wnt3-3′-UTR报告基因的荧光素酶活性没有影响(P>0.05)。 qRT-PCR和Western blot实验结果(图3C和3D)显示,上调miR-515-5p可以降低Wnt3的mRNA和蛋白表达(P<0.05),而下调miR-515-5p则相反(P<0.05)。
2.4 Wnt3可以逆转miR-515-5p mimic对胃癌细胞的影响
为了进一步说明Wnt3确实是 miR-515-5p调节肝癌细胞增殖和侵袭的下游靶基因,用转染MGC-803和SGC-7901细胞。 然后,Western blot实验(图4A)验证Wnt3的表达水平增加(P<0.05)。CCK-8实验结果(图4B)表明,过表达Wnt3逆转了miR-515-5p对细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。Transwell实验结果(图4C)表示,过表达Wnt3削弱了miR-515-5p对细胞侵袭的抑制作用(P<0.05)。与此同时,Western blot实验(图4D)表明,过表达miR-515-5p抑制了MGC-803和SGC-7901细胞中β-catenin(β-连环蛋白,Wnt3的下游作用分子)的表达(P<0.05),而过表达Wnt3则逆转了这种抑制作用。以上结果表明,miR-515-5p通过靶向Wnt3抑制胃癌细胞增殖和侵袭。
3讨论
越来越多的数据证实,miRNA在胃癌发生和转移中起着重要的作用。例如,miR-92、miR-338-3p抑制胃癌细胞增殖,诱导凋亡[12-13];miR-423-5p和miR-324-3p促进肿瘤生长和转移[14-15]。近年来,miR-515-5p在肿瘤发生和转移中的临床价值和生物学作用成为研究热点,然而关于其在胃癌中的作用和机制尚不是非常明确。在本研究中,miR-515-5p在胃癌组织和细胞系中表达水平显著下调。miR-515-5p的过表达抑制了胃癌细胞在体外的增殖和侵袭。这些结果提示miR-515-5p可能是胃癌发生和发展中的抑制因子,有望成为一个潜在的胃癌治疗的分子靶点。
关于miR-515-5p对胃癌细胞增殖和侵袭的影响可能是通过调控其靶向的基因实现的。为了探索miR-515-5p介导的肿瘤抑制作用中涉及的调节机制,通过预测网站分析发现Wnt3是miR-515-5p的潜在靶基因。进一步通过双荧光素酶报告基因检测,qRT-PCR以及Western blot实验验证了miR-515-5p和Wnt3的靶向关系。Wnt3即Wingless型MMTV整合位点家族成员3,是一种分泌型糖蛋白,位于人类17号染色体上,是经典Wnt/β-连环蛋白途径的上游蛋白质[16]。Wnt信号通路是典型的信号转导级联,在胚胎发育、细胞增殖、存活和凋亡过程中起着重要作用。经典的Wnt/β-连环蛋白途径通过激活其下游基因的转录参与几种癌症的发生和发展。简而言之,当被信号刺激时,Wnt蛋白与跨膜受体结合以激活蓬乱蛋白(DVL)的表达,其抑制降解复合物中GSK3β的活性,阻止GSK3β对β-catenin的磷酸化,从而避免了泛素或蛋白酶体对其识别和降解。然后,β-catenin在细胞质中积累并转移到细胞核,并与核转录因子结合并激活下游靶基因的表达,最终导致细胞的异常增殖和肿瘤的发生[17]。Wnt3是识别和结合受体复合物启动通路激活的基本成分之一,Wnt3在人类癌症中经常上调,并通过激活Wnt/β-catenin信号通路,在癌症中发挥关键作用[18-19]。在胃癌中,Wnt3表达显着升高,沉默Wnt3显著阻断了细胞增殖,延缓细胞周期,抑制细胞的侵袭和转移,并伴有较高的凋亡率,并且沉默Wnt3能够抑制Wnt/β-catenin通路中β-catenin基因的表达[20]。我们的研究结果表明,miR-515-5p在胃癌细胞中的异位过表达通过靶向Wnt3基因的3′UTR抑制Wnt3蛋白的表达,而Wnt/β-catenin途径的下游蛋白β-catenin也可以被抑制,而同时过表达Wnt3则逆转了对miR-515-5p过表达对β-catenin的抑制作用。由此证明miR-515-5p在通过调节Wnt/β-catenin途径的活性而实现抑制胃癌细胞增殖和侵袭中的作用。
文章来源:《中国微侵袭神经外科杂志》 网址: http://www.zgwqxsjwkzz.cn/qikandaodu/2020/1112/358.html
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