miR-515-5p通过靶向Wnt3抑制胃癌细胞增殖和侵(3)
综上所述,本研究证实在胃癌中miR-515-5p下调,且通过Wnt3/β-catenin信号通路抑制了胃癌细胞的增殖和侵袭,这可能为胃癌治疗提供新的治疗思路。
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胃癌是全球第四大常见癌症,也是全球癌症相关死亡的第二大原因[1], 其中大半发生在东亚,尤其是中国[2]。大多数胃癌患者在晚期才被诊断出来,预后差,5年生存率低[3],其中一个影响原因是缺乏有效的早期诊断生物标志物。因此,研究胃癌的分子机制,确定早期诊断的生物标志物和更有效治疗的新靶点是十分必要的。Micrornas (miRNAs)是长度为19~24个核苷酸的小的非编码RNA,其通过直接靶向3′-非翻译区(3′-UTR)来抑制翻译或促进靶mRNA的降解[4]。 越来越多的证据表明异常miRNA在包括胃癌在内地多种人类癌症的发生和发展过程中起着致癌基因或肿瘤抑制因子的作用[5-7]。 例如, miR-21在胃癌中过表达并通过负调节重要的肿瘤抑制基因如PTEN,PDCD4和RECK促进肿瘤增殖和侵袭[8-10],miR-148b-3p通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42轴抑制胃癌转移[11]。然而, miR-515-5p在胃癌中的调控作用和分子机制尚不是非常明确。因此,本文旨在研究miR-515-5p是否可以在胃癌细胞中调节Wnt3的表达进而调控胃癌的进展。1材料与方法1.1 材料采集了2016年4月至2017年5月在广西壮族自治区南溪山医院接受肿瘤切除的60例患者的胃癌组织和邻近正常组织样本。 招募到本研究的患者均未接受任何术前治疗。手术切除后,立即将标本冷冻于液氮中,并于-80 ℃保存,以作进一步分析。本研究得到了广西壮族自治区伦理委员会的批准,并获得了所有患者的知情同意。使用的人胃癌细胞株MGC-803,BGC-823,HGC-27和SGC-7901细胞系均购自上海中国科学院细胞库。人正常胃上皮细胞系(GES1)购自American Type Culture Collection。RPMI-1640基础培养基、胎牛血清购于Gibco公司。miR-515-5p阴性对照(NC mimic)或模拟物(miR-515-5p mimic)转染试剂,Wnt3质粒购自广州锐博公司。Lipofectamine 2000、Trizol试剂、M-MLVRT逆转录试剂盒、SYBR?Green qPCR SuperMix试剂盒购自美国Invitrogen公司,SYBR?Green PCR Master Mix购自日本Toyobo公司。CCK-8试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司。transwell试剂盒购自美国Corning Costar公司。一抗抗体Wnt3,E-cadherin,N-cadherin及GADPH 抗体均购自美国Abcam公司。双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司 方法1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养细胞。所有培养基均添加青霉素100 U/mL和链霉素100 lg/mL,细胞保存于37 ℃、5% CO2的湿化培养箱中 细胞转染 使用Lipofectamine 2000转染试剂,根据说明书以40 nmol/L每个细胞的浓度转染miR-515-5p模拟物(miR-515-5p mimic),抑制物(miR-515-5p inhibitor)或相应的对照物(NC mimic,NC inhibitor)。Wnt3过表达质粒()和对照质粒(),并且2 μg的质粒通过Lipofectamine 2000转染至每个细胞。采用qRT-PCR和蛋白免疫印迹法检测转染效率 qRT-PCR 根据说明书用Trizol试剂从培养的细胞中提取总RNA。用M-MLVRT逆转录试剂盒合成cDNA。利用SYBR?Green PCR Master Mix扩增cDNA。采用SYBR?Green qPCR SuperMix检测mRNA水平。以U6 和GAPDH分别作为miR-515-5p和Wnt3的内参基因。使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。引物序列为:miR-515-5p, 5′-GCTTCGGTTAATGCTAATCGTG-3′(上游), 5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′(下游);Wnt3:forward, 5′-CCACAACACGAGGACGGAGA-3′(上游),5′-CGCCCAGCCACACACTTC-3′(下游);U6: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游), 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游);GAPDH:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′ (上游),5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′(下游) 细胞增殖实验 采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8),按照说明将2 000个细胞接种到96孔板中,孵育24 h、48 h、72 h、96 h。加入 CCK-8试剂后,孵育2 h。使用分光光度计在450 nm波长(OD值)下的吸光度,平均OD值用于估计各组细胞数 细胞侵袭实验 通过使用具有8 mm孔径的Transwell小室测定细胞的侵袭能力。将Transwell小室放入24孔板中。 首先,我们将0.1 mL 基底膜基质(Matrigel,50 μg/mL)加到板表面上并孵育2 h。 将100 μL细胞悬浮液(1×105个细胞)悬浮于不含胎牛血清的RPMI 1640中,然后加入每个用Matrigel包被的插入物的上室中。 接下来,将500 μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640加入下室中。 将细胞在5% CO2湿润的培养箱中温育24~48 h。 温育后,用95%乙醇洗涤细胞并用结晶紫染色。通过棉签除去上表面上的细胞,在光学显微镜下拍照,并对侵入底部表面的细胞进行计数 Western blot实验 转染后从细胞中分离出总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度,并按照说明进行检测。样品经12% SDS-PAGE电泳。然后将蛋白转移到PVDF膜上。在脱脂乳中封闭后,用特定的一抗Wnt3,GAPDH (1∶1 000)在4 ℃中孵育过夜。然后将印迹膜与HRP标记的抗小鼠IgG(1∶2 000)抗体在室温下孵育2 h。利用增强化学发光(ECL)检测系统观察蛋白质。GAPDH作为内参 双荧光素酶报告实验 通过miRDB网站( mRNA的3′-UTR处的潜在结合位点。由南京Genescript公司合成含有与miR-515-5p结合的野生型(WT)或突变(MUT)的Wnt3的3′-UTR序列,并克隆到pGL-3荧光素酶报告载体中。 将荧光素酶报告载体与miR-515-5p mimic,miR-515-5p inihibitor,对照模拟物(NC mimic)或对照抑制物(NC inhibitor)共转染MGC-803和SGC-7901细胞。 通过双荧光素酶报告基因检测系统(Promega,Madison,WI,USA)检测荧光素酶活性,将萤火虫荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性 统计学方法所有实验重复至少三次。使用SPSS 22.0(Chicago,IL,USA)或GraphPad Prism 7.0进行统计学分析。所有实验的数据表示为至少三次独立实验的采用t检验,秩和检验 (两组)和单因素方差分析(多组)进行差异分析。P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1 miR-515-5p在胃癌组织和细胞系中表达水平下调我们通过qRT-PCR检测了60对胃癌及其癌旁组织中miR-515-5p的表达水平,qRT-PCR(图1A)结果显示,miR-515-5p在胃癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.0001)。此外,我们检测了4个胃癌细胞系(MGC-803,BGC-823,HGC-27,SGC-7901)中miR-515-5p的表达。qRT-PCR (图1B)结果显示,与人正常胃上皮细胞(GES1)相比,miR-515-5p在所有GC细胞系中的表达均显著降低 (P<0.0001)。这些结果表明miR-515-5p可能在胃癌中起肿瘤抑制作用。图1miR-515-5p 在胃癌组织和细胞系中表达水平 A:qRT-PCR 检测了60对胃癌组织和癌旁组织中miR-515-5p的表达;B:qRT-PCR 检测胃癌细胞系(MGC-803,BGC-823,HGC-27,SGC-7901)和人正常胃上皮细胞(GES1)中miR-515-5p 的表达,与GES1组比较,**P<0.01,***P<0.0012.2 过表达miR-515-5p抑制胃癌细胞增殖和侵袭为了评估miR-515-5p在胃癌发展中的作用,我们分别使用miR-515-5p mimic或miR-515-5p inhibitor转染MGC-803和SGC-7901细胞,通过qRT-PCR检测转染效率,图 2A结果表明 miR-515-5p表达显著增加或减少(P<0.05),证明转染成功。CCK-8检测结果(图2B)显示,miR-515-5p可显著降低MGC-803和SGC-7901细胞增殖能力(P<0.05)。Transwell实验(图2C)表明,转染miR-515-5p mimic的胃癌细胞的侵袭能力明显低于转染阴性对照模拟物(NC mimic)的细胞(P<0.05)。这些结果表明miR-515-5p可以显著抑制胃癌细胞增殖和侵袭能?Wnt3是miR-515-5p的直接下游靶点为了探索miR-515-5p调控胃癌细胞增殖和侵袭的分子机制,我们使用miRDB数据库( mimic显著抑制野生型Wnt3的3′-UTR的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型的Wnt3-3′-UTR报告基因的荧光素酶活性没有影响(P>0.05)。 qRT-PCR和Western blot实验结果(图3C和3D)显示,上调miR-515-5p可以降低Wnt3的mRNA和蛋白表达(P<0.05),而下调miR-515-5p则相反(P<0.05) Wnt3可以逆转miR-515-5p mimic对胃癌细胞的影响为了进一步说明Wnt3确实是 miR-515-5p调节肝癌细胞增殖和侵袭的下游靶基因,用转染MGC-803和SGC-7901细胞。 然后,Western blot实验(图4A)验证Wnt3的表达水平增加(P<0.05)。CCK-8实验结果(图4B)表明,过表达Wnt3逆转了miR-515-5p对细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。Transwell实验结果(图4C)表示,过表达Wnt3削弱了miR-515-5p对细胞侵袭的抑制作用(P<0.05)。与此同时,Western blot实验(图4D)表明,过表达miR-515-5p抑制了MGC-803和SGC-7901细胞中β-catenin(β-连环蛋白,Wnt3的下游作用分子)的表达(P<0.05),而过表达Wnt3则逆转了这种抑制作用。以上结果表明,miR-515-5p通过靶向Wnt3抑制胃癌细胞增殖和侵袭。图2过表达miR-515-5p抑制胃癌细胞增殖和侵袭 A: qRT-PCR检测转染miR-515-5p mimic和inhibitor胃癌细胞中miR-515-5p 的表达水平;B:CCK-8 试验检测胃癌细胞的增殖能力; C:Transwell 试验检测细胞的侵袭能力。与NC mimic组比较,**P<0.01,***P<0.001;与NC inhibitor组比较,##P<0.01图3Wnt3是miR-515-5p的直接下游靶点 A:miR-515-5p 与Wnt3的3′-UTR预测的结合序列;B:双荧光素酶报告实验检测miR-515-5p 与Wnt3的3′-UTR 结合情况;C:qRT-PCR检测各组细胞中Wnt3的mRNA 表达;D:Western blot 检测各组细胞中Wnt3的蛋白表达。与NC mimic组比较,**P<0.01;与NC inhibitor组比较,##P<0.013讨论越来越多的数据证实,miRNA在胃癌发生和转移中起着重要的作用。例如,miR-92、miR-338-3p抑制胃癌细胞增殖,诱导凋亡[12-13];miR-423-5p和miR-324-3p促进肿瘤生长和转移[14-15]。近年来,miR-515-5p在肿瘤发生和转移中的临床价值和生物学作用成为研究热点,然而关于其在胃癌中的作用和机制尚不是非常明确。在本研究中,miR-515-5p在胃癌组织和细胞系中表达水平显著下调。miR-515-5p的过表达抑制了胃癌细胞在体外的增殖和侵袭。这些结果提示miR-515-5p可能是胃癌发生和发展中的抑制因子,有望成为一个潜在的胃癌治疗的分子靶点。图4Wnt3可以逆转miR-515-5p mimic对胃癌细胞的影响 A:Western blot检测Wnt3的表达水平;B:CCK-8 试验检测胃癌细胞的增殖能力;C:Transwell 试验检测细胞的侵袭能力;D:Western blot检测β-catenin的表达水平。与NC mimic组比较,**P<0.01,***P<0.001关于miR-515-5p对胃癌细胞增殖和侵袭的影响可能是通过调控其靶向的基因实现的。为了探索miR-515-5p介导的肿瘤抑制作用中涉及的调节机制,通过预测网站分析发现Wnt3是miR-515-5p的潜在靶基因。进一步通过双荧光素酶报告基因检测,qRT-PCR以及Western blot实验验证了miR-515-5p和Wnt3的靶向关系。Wnt3即Wingless型MMTV整合位点家族成员3,是一种分泌型糖蛋白,位于人类17号染色体上,是经典Wnt/β-连环蛋白途径的上游蛋白质[16]。Wnt信号通路是典型的信号转导级联,在胚胎发育、细胞增殖、存活和凋亡过程中起着重要作用。经典的Wnt/β-连环蛋白途径通过激活其下游基因的转录参与几种癌症的发生和发展。简而言之,当被信号刺激时,Wnt蛋白与跨膜受体结合以激活蓬乱蛋白(DVL)的表达,其抑制降解复合物中GSK3β的活性,阻止GSK3β对β-catenin的磷酸化,从而避免了泛素或蛋白酶体对其识别和降解。然后,β-catenin在细胞质中积累并转移到细胞核,并与核转录因子结合并激活下游靶基因的表达,最终导致细胞的异常增殖和肿瘤的发生[17]。Wnt3是识别和结合受体复合物启动通路激活的基本成分之一,Wnt3在人类癌症中经常上调,并通过激活Wnt/β-catenin信号通路,在癌症中发挥关键作用[18-19]。在胃癌中,Wnt3表达显着升高,沉默Wnt3显著阻断了细胞增殖,延缓细胞周期,抑制细胞的侵袭和转移,并伴有较高的凋亡率,并且沉默Wnt3能够抑制Wnt/β-catenin通路中β-catenin基因的表达[20]。我们的研究结果表明,miR-515-5p在胃癌细胞中的异位过表达通过靶向Wnt3基因的3′UTR抑制Wnt3蛋白的表达,而Wnt/β-catenin途径的下游蛋白β-catenin也可以被抑制,而同时过表达Wnt3则逆转了对miR-515-5p过表达对β-catenin的抑制作用。由此证明miR-515-5p在通过调节Wnt/β-catenin途径的活性而实现抑制胃癌细胞增殖和侵袭中的作用。综上所述,本研究证实在胃癌中miR-515-5p下调,且通过Wnt3/β-catenin信号通路抑制了胃癌细胞的增殖和侵袭,这可能为胃癌治疗提供新的治疗思路。参考文献[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. 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文章来源:《中国微侵袭神经外科杂志》 网址: http://www.zgwqxsjwkzz.cn/qikandaodu/2020/1112/358.html
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