长链非编码RNA ROR1-AS1 促进骨肉瘤细胞侵袭的(3)
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骨肉瘤(osteosarcoma,OS)发病年龄轻,致死率高[1-2],易转移[3]。手术和化疗虽有一定效果,但死亡率和转移率仍然居高不下[4-5]。因此,阐明OS 的侵袭机制,寻找生物标志物,至关重要。非编码RNA 在肿瘤的发展中占据重要地位[6]。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)包含200 个以上核苷酸,从表观遗传学、转录和转录后调控等层面参与生物体的调控过程[7-9],并通过多种机制影响基因和蛋白的表达[10-12]。本研究发现lncRNA ROR1-AS1 在OS 中过表达,并探讨其在OS 细胞侵袭中的作用机制。1 材料与方法1.1 材料人成骨细胞NHOst 和人OS 细胞株HOS、Saos-2、U20S 和MG63(购自ATCC)。胎牛血清(TBD,中国)、DMEM 培养基(Gibico,美国),无菌培养箱(Thermo,美国);lncRNA ROR1-AS1 的si-RNA 慢病毒、对照病毒、ROR1 过表达质粒,定量引物(Genechem,中国);PCR 引物[生工生物工程(上海)股份有限公司,中国],SYRB Green 染料(Invitrogen,美国,S7563)及逆转录试剂盒(TakaRa,日本,RR037A)。Transwell 小室(Corning,美国),稀释基质胶(BD,美国),Lipofectamine 2000 (Invitrogen,美国,),PCR 仪(ROCHE,瑞士);抗体ROR1,E-caderin,N-caderin,抗体(ab cam,美国,ab、ab76 055、ab,1∶ 细胞培养含10%胎牛血清的DMEM 培养基(含青链霉素)培养细胞,克隆至70%~80%更换培养基;培养箱条件:37℃、50 mL/L RT-PCR检测各细胞株中lncRNA ROR1-AS1 的表达。TRIzol 法提总RNA,并检测纯度及浓度。依据TaKaRa公司说明书进行逆转录和PCR 反应。反应体系20 μL:2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL;上、下游引物各0.4 μL;cDNA 5 μL;双蒸水4.2 μL。设定程序为两步法RTPCR:预变性95℃,1 min;之后每一步变性95℃,5 s;退火延伸60℃,20 s;共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。lncRNA ROR1-AS1 的上游引物序列为5′-CTGACGAAACACTGGAACTC-3′,下游引物序列为5′-GTCTGATTTGGTAGCTTGGATG-3′;ROR1 的上游引物序列为5′-CAGATGAGTATGAAGAAGATGG-3′,下游引物序列为5′-ATGGCGAAC-TGAGAACAC-3′;U6 作为内参进行相对定量,U6 的上游引物序列为5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′,下游引物序列为5′-CACTATTGCGGGCTGC-3′。采用2-△△Ct法计算两者的相对表达量,重复3 次 细胞转染依据基因转染操作手册,采用Lipofectamine 2000 将过表达和沉默载体(si-lncRNA ROR1-AS1#1,si-lncRNA ROR1-AS1#2)转染进入细胞。经48 h转染后,观察细胞生长情况,收集细胞用于进一步研究 Transwell37℃无菌条件下,50 μg 细胞外基质(ECM)胶加入8 μm 孔径的Transwell 小室,放置6 h 进行包被;ECM 胶充分凝固后,于上室加入不含抗生素及血清的培养基,接种细胞2×105个/孔,下室加入含10%血清无抗生素的培养基;24 h 后取出小室,无菌棉签擦拭去除上室内的细胞,1%结晶紫染液对小室多孔膜下表面的细胞染色,拍照,计数。染色的细胞穿膜越多,代表侵袭能力越强 划痕试验细胞接种于6 孔板,垂直于孔板采用100 μL 枪头制作细胞划痕,确保各个划痕宽度基本一致。去除培养液,PBS 冲洗孔板,去除细胞碎片。加入不含血清培养基,拍照记录。培养板置入培养箱24 h 后,再分别拍照记录,计算划痕距离百分比 Western-blot提取细胞总蛋白,制备8%聚丙烯酰胺凝胶,每孔20 μg 上样;80 V 积层胶,120 V 分离胶进行电 泳,100 V 转膜90 min,5% BSA 封闭PVDF 膜1 h,加一抗,4℃振荡过夜。TBST 洗涤后滴加二抗,37℃孵育1 h,显影成像。特异性条带净灰度值由Image J 软件获?统计学方法采用SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差()表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t 检验,计数资料采用百分率表示,组间比较采用χ2检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 lncRNA ROR1-AS1 和ROR1 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中的表达情况RT-PCR 显示,与NHOst 比较,lncRNA ROR1-AS1和ROR1 在HOS、MG63、U20S、Saos-2 中表达明显升高(P <0.01)。见图1。图1 lncRNA ROR1-AS1 和ROR1 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中的表达情况A.lncRNA ROR1-AS1 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中表达差异; 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中表达差异。与NHOst 比较,**P <0.01。OS:骨内瘤2.2 抑制lncRNA ROR1-AS1 表达后lncRNA ROR1-AS1 和ROR1 表达变化HOS 和MG63 中转染lncRNA ROR1-AS1 的siRNA 后,lncRNA ROR1-AS1 表达量明显降低(P <0.05 或P <0.01);同时,ROR1 的表达量也随之下降(P <0.05 或P <0.01)。si-lncRNA ROR1-AS1#1 具有更好的沉默效能,用于后续实验。见图2。图2 抑制lncRNA ROR1-AS1 表达后lncRNA ROR1-AS1和ROR1 表达变化A.转染si-lncRNA ROR1-AS1 前后OS 中lncRNA ROR1-AS1 表达情况;HOS 和MG63 中 转 染si-lncRNA ROR1-AS1 (#1 和#2),lncRNA ROR1-AS1 表达下降(*P<0.05,**P<0.01);B.转染si-lncRNA ROR1-AS1后OS 细胞中ROR1 mRNA 表达情况;HOS 和MG63 中转染si-lncRNA ROR1-AS1(#1 和#2),ROR1 表达下降(*P<0.05,**P<0.01)2.3 lncRNA ROR1-AS1、ROR1 对OS 细胞侵袭转移能力的影响Transwell 中,转染si-lncRNA ROR1-AS1#1 后,lncRNA ROR1-AS1 表达量下降,细胞迁移数量减少;在此基础上过表达ROR1,被抑制的细胞侵袭能力部分恢复(P <0.05)。见图3。图3 Transwell 验证lncRNA ROR1-AS1-NC、si-lncRNA ROR1-AS1 和si-lncRNA ROR1-AS1+ROR1 组细胞侵袭转移能力的比较A.结晶紫染色(200×);B.细胞数量统计图。与NC 比较,*P <0.05划痕实验,转染si-lncRNA ROR1-AS1#1 后,细胞运动距离减少,细胞的运动能力下降;在此基础上过表达ROR1,细胞运动距离增加(P <0.05 或P <0.01)。见图4。图4 Scrape 验证lncRNA ROR1-AS1-NC、si-lncRNA ROR1-AS1 和si-lncRNA ROR1-AS1+ROR1 组细胞侵袭转移能力的比较A.划痕实验(200×);B.细胞数量统计图。与NC-24 h 比较,*P <0.052.4 lncRNA ROR1-AS1 经由ROR1 介导OS 细 胞上皮间质转化检测lncRNA ROR1-AS1 对上皮间质转化(EMT)的影响,抑制lncRNA ROR1-AS1 表达,间质表型标志物N-cadherin 表达下降,而上皮表型标志物Ecadherin 表达上调;过表达ROR1 后,N-cadherin 表达上升,而E-cadherin 表达下降。见图5。说明lncRNA ROR1-AS1 经由ROR1 参与OS 的EMT。图5 LncRNA ROR1-AS1 经由ROR1 介导OS 细胞EMTOS:骨肉瘤;EMT:上皮间质转化3 讨论肿瘤侵袭是造成患者死亡的主要原因[13]。而EMT是肿瘤侵袭中的重要环节,上皮细胞标志物表达下降,间质细胞标志物表达升高,便于肿瘤细胞从原发灶脱离,出现侵袭转移[14]。ROR1 的功能在神经系统、循环系统和呼吸系统的中首先发现[15]。ROR1 在OS等肿瘤中过表达,同肿瘤病理过程相关[16]。ROR1 可以促进EMT 和诱导增殖、迁移[17]。Dai 等[18]指出ROR1 通过非经典wnt 信号通路参与OS 的侵袭。LncRNA ROR1-AS1 位于人基因组1p31.3,是ROR1 基因转录的反义lncRNA。Hu 等[19]首次对其功能进行报道:可与EZH2/PRC2 结合参与基因转录调控[19]。lncRNA 可通过顺式作用调节临近的基因的转录[20],所以我们推测lncRNA ROR1-AS1 可通过调控ROR1 参与OS 的侵袭。本研究显示,lncRNA ROR1-AS1 在OS 中过表达,抑制lncRNA ROR1-AS1 表达,ROR1 表达量随之下降,OS 细胞的侵袭能力下降,EMT 的上皮表型标志物表达增高,而间质表型标志物表达降低;在此基础上过表达ROR1,OS 细胞的侵袭能力恢复,EMT 上皮表型标志物表达下降,间质表型标志物表达升高;提示lncRNA ROR1-AS1 对OS 细胞的侵袭作用的调控是依赖ROR1 的。但其具体分子结合位点及转录调控机制,仍需在后续研究中进一步探讨。[参考文献][1]Kager L,Tamamyan G,Bielack S.Novel insights and therapeutic interventions for pediatric osteosarcoma [J].Future Oncol,2017,13(4):357-368.[2]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2019 [J].CA Cancer J Clin,2019,69(1):7-34.[3]Oh JY,Kim EH,Lee YJ,et Autophagy Effect of miR-212-3p in Zoledronic Acid-Treated In Vitro and Orthotopic In Vivo Models and in Patient-Derived Osteosarcoma Cells [J].Cancers (Basel),2019,11(11).pii:E1812.[4]Faisham WI,Mat Saad AZ,Alsaigh LN,et factors and survival rate of osteosarcoma:A single-institution study [J].Asia Pac J Clin Oncol,2017,13(2):e104-e110.[5]Moreno F,Cacciavillano W,Cipolla M,et osteosarcoma:Incidence and survival in from the National Pediatric Cancer Registry,ROHA Network 2000-2013 [J].Pediatr Blood Cancer,2017,64(10).[6]Schmitt AM,Chang HY.Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways [J].Cancer Cell,2016,29(4):452-463.[7]Bartonicek N,Maag JL,Dinger ME.Long noncoding RNAs in cancer:mechanisms of action and technological advancements [J].Mol Cancer,2016,15(1):43.[8]Qu Z,Li S.Long noncoding RNA LINC01278 favors the progression of osteosarcoma via modulating miR-133a-3p/PTHR1 signaling [J].J Cell Physiol,2020.[9]Hou XK,Mao JS.Long noncoding RNA SNHG14 promotes osteosarcoma progression via miR-433-3p/FBXO22 axis[J].Biochem Biophys Res Commun,2020,523(3):766-772.[10]Morris KV,Mattick JS.The rise of regulatory RNA [J].Nat Rev Genet,2014,15(6):423-437.[11]Mattick JS,Rinn and annotation of long noncoding RNAs [J].Nat Struct Mol Biol,2015,22(1):5-7.[12]Salmena L,Poliseno L,Tay Y,et al.A ceRNA hypothesis:the Rosetta Stone of a hidden RNA language? 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文章来源:《中国微侵袭神经外科杂志》 网址: http://www.zgwqxsjwkzz.cn/qikandaodu/2021/0120/407.html