miR-660-3p下调REG4对胃癌细胞增殖、迁移、侵(2)
(2)侵袭实验:将事先液化的Matrigel用4 ℃无血清RPMI-1640培养基1∶6比例稀释,取100 μL加入上层Transwell小室,37 ℃使其固化,以下步骤同迁移实验。
1.2.6 双荧光素酶报告实验 根据方法1.2.2进行MGC-803细胞培养和转染,分别将构建的REG4的野生型(WT-REG4)和突变型(MUT-REG4)双荧光素酶报告载体与miR-NC或miR-660-3p共转染MGC-803细胞,转染48 h后收集细胞,将细胞裂解,离心收集上清,发光仪检测上清中的荧光素活性。以海肾荧光素酶活性为内参照,计算相对萤火虫荧光素酶活性。
1.2.7 Western blot检测蛋白表达 离心收集各组MGC-803细胞,室温裂解细胞并超声破碎,收集蛋白质,检测浓度后进行SDS-PAGE,转PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,洗涤,加入稀释的一抗(抗REG4抗体 1∶1 000、抗CyclinD1抗体1∶3 000、抗p21抗体1∶2 000、抗E-cadherin抗体1∶2 000、抗MMP-2抗体1∶3 000和抗GAPDH抗体1∶4 000),4 ℃过夜孵育,然后用PBST洗3次,加入稀释的HRP标记二抗,室温孵育2 h,洗涤2次,显影,分析蛋白水平,以GAPDH为内参照。
1.3 统计学方法
数据采用 SPSS 17.0统计软件进行处理。正态分布计量资料以表示,组间比较采用独立样本t检验或单因素方差进行分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 miR-660-3p在胃癌组织和癌旁组织中的表达
结果表明,与正常癌旁组织组相比,胃癌组织组的miR-660-3p表达量显著降低(P<0.05),见表1。
表1miR-660-3p在胃癌组织和癌旁组织中的表达分组样本数miR-660-3p癌旁组织1340.胃癌组织1340.值- 91.246P值-0.000
2.2 过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖的影响
结果表明,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p组的miR-660-3p表达量显著升高(P<0.05),增殖相关蛋白Cyclin D1表达降低(P<0.05),增殖负调控蛋白p21显著上调(P<0.05),细胞OD490 nm在24 h、48 h和72 h均显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05),见图1和表2。说明过表达miR-660-3p可抑制MGC-803细胞增殖。
表2过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖的影响分组miR-660-3pCyclin D1蛋白P21蛋白细胞活性(OD 490 nm)24 h48 h72 hmiR-NC0.-660-3p0.值18...9274..值
2.3 过表达miR-660-3p可抑制胃癌细胞MGC-803迁移和侵袭
结果显示,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p组的MGC-803细胞中跨膜蛋白E-cadherin表达量显著上升(P<0.05),MPP-2表达量显著下降(P<0.05),迁移和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05),见图2和表3。说明抑制miR-660-3p可抑制MGC-803细胞迁移和侵袭。
表3过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803迁移、侵袭的影响分组E-cadherin蛋白MMP-2蛋白迁移细胞数侵袭细胞数miR-NC0.-660-3p0.值.值
2.4 miR-660-3p靶向调控REG4
Targetscan预测结果显示,REG4的3′UTR含有与miR-660-3p互补的核苷酸序列,见图3A。双荧光素酶报告实验结果如表4所示,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p可使野生型WT-REG4的荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05);而突变型MUT-REG4的荧光素酶相对活性没有明显变化。Western blot结果表明,过表达miR-660-3p组的REG4 蛋白表达量显著降低(P<0.05);抑制miR-660-3p表达组的REG4 表达量显著升高(P<0.05),见图3B和表5。说明miR-660-3p靶向负调控REG4的表达。
表4双荧光素酶报告实验分组WT- REG4MUT- REG4miR-NC0.-660-3p0.值18.598 0.346P值
表5miR-660-3p调控REG4的表达分组REG4蛋白miR-NC0.-660-3p0.-miR-NC0.- miR-660-3p1.值264.508P值0.000
2.5 过表达REG4可逆转过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖、迁移和侵袭的作用
结果(图4、表6和表7)所示,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p组的结果与结果2.2和2.3一致,过表达miR-660-3p抑制MGC-803中REG4表达(P<0.05),抑制细胞增殖、迁移和侵袭;与miR-660-3p+pcDNA3.1组相比,同时过表达miR-660-3p和REG4组MGC-803中REG4表达量升高(P<0.05),Cyclin D1和E-cadherin表达量上升(P<0.05),p21和MPP-2表达降低(P<0.05),细胞OD490nm显著升高(P<0.05),迁移和侵袭细胞数均显著增多(P<0.05),差异均具有统计学意义。说明过表达REG4可逆转过表达miR-660-3p对MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。
表6过表达REG4表达可逆转过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖的作用分组Cyclin D1蛋白P21蛋白细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 hmiR-NC0.-660-3p0.-660-3p+-660-3p+ REG40.值214.....474P值0.000
表7过表达REG4表达可逆转过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803迁移和侵袭的作用分组REG4蛋白E-cadherin蛋白MMP-2蛋白迁移细胞数侵袭细胞数miR-NC0.-660-3p0.-660-3p+-660-3p+ REG40.值203.....372P值0.000
3讨论
根据2015年中国癌症统计结果,我国胃癌死亡率仅次于肺癌,位居肿瘤死亡率第二位[8]。癌症转移是患者死亡主要原因,研究胃癌转移机制是基础研究的热点。
文章来源:《中国微侵袭神经外科杂志》 网址: http://www.zgwqxsjwkzz.cn/qikandaodu/2020/1112/359.html
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