miR-660-3p下调REG4对胃癌细胞增殖、迁移、侵(4)
[18] Wang H, Hu L, Zang M, et al. REG4 promotes peritoneal metastasis of gastric cancer through GPR37[J]. Oncotarget, 2016,7(19): -.
[19] Jin J, Lv H, Wu J, et al. Regenerating Family Member 4 (Reg4) Enhances 5-Fluorouracil Resistance of Gastric Cancer Through Activating MAPK/Erk/Bim Signaling Pathway[J]. Med Sci Monit, 2017,23:3715-3721.
[20] Zhang XQ, Yu LT, Du P, et al. Single-chain Antibody Against Reg4 Suppresses Gastric Cancer Cell Growth and Enhances 5-FU-induced Cell Death in vitro[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2019,19(5):610-619.
胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,我国胃癌发病和死亡病例大约是全球的45%[1]。因确诊时多为晚期,错过最佳手术根治时机,晚期胃癌主要治疗方法是新辅助放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗相结合[2]。研究胃癌的分子靶点,对胃癌靶向治疗极为重要。研究表明,miRNA(micro RNA)的异位表达在胃癌增殖、迁移、侵袭和凋亡都具有重要作用,是胃癌诊断和治疗的潜在生物标志物[3]。有研究应用微阵列芯片技术比较胃癌与癌旁正常组织miRNA差异表达谱发现,在胃癌组织中miR-660-3p表达下调,且其可能参与胃癌发生的调控,是潜在的胃癌标志物[4],但目前miR-660-3p对胃癌细胞的影响及其机制尚不清楚。miR-660-3p和miR-660-5p均是miR-660的成熟miRNA。本研究通过TargetScan预测发现,REG4(Regenerating islet-derived family member 4)可能是miR-660-3p的靶基因。REG4是胃癌的一个诊断标志物,研究发现REG4在胃癌患者中高表达[5]。高表达REG4与胃癌晚期和不良预后相关,REG4过表达可通过增加粘附能力显著增强腹膜转移[6],并有研究证明体外干扰REG4表达可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进凋亡[7],而miR-660-3p和REG4两者在胃癌中的作用机制和关系尚不清楚。本课题以人胃癌细胞系MGC-803为研究对象,探讨胃癌细胞中miR-660-3p靶向REG4调控对癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。1材料与方法1.1 材料1.1.1 标本 选取本院2015年6月至2017年12月手术切除经病理检查确诊为胃癌的胃癌组织标本和癌旁正常组织(与癌组织临近且>1.5 cm)各134例,患者年龄21~72岁,平均年龄(47.)岁,组织标本切除前患者均未进行放化疗等。所有标本用途均与患者说明,并与患者签订知情同意书 试剂和仪器 人胃癌细胞株MGC-803购自北京北纳生物;牛血清白蛋白(Bovine Serun Albumin,BSA)、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和四氮唑蓝(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)购自美国Sigma-Aldrich公司;Transwell板购自美国Corning公司;RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司;Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂TRIzol、 real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司;引物、miR-660-3p模拟物(miR-660-3p)、抑制剂(anti-miR-660-3p)、REG4的过表达载体()、空载体和阴性对照(miR-NC和anti-miR-NC)及双荧光载体的构建购自上海吉玛制药有限公司;双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司;REG4抗体、CyclinD1抗体、p21抗体、E-cadherin抗体、MMP-2抗体和GAPDH抗体购自英国Abcam;显微镜、酶标仪、发光仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司 方法1.2.1 细胞培养 将胃癌MGC-803细胞培养于含10% FBS、1% 青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液中,置于饱和湿度,37 ℃ 5% CO2培养箱培养,细胞生长至对数生长期,消化传代 细胞转染 将MGC-803细胞接种在6孔板中(2×l05个细胞/孔)培养,当细胞融合为一层时进行转染。根据转染试剂说明书进行操作,用无血清培养液稀释脂质体Lipofectamine 2000和各组载体,转染培养好的MGC-803细胞,培养6 h,弃培养液,换成RPMI-1640培养基,转染48 h,收集细胞,验证转染效果,进行后续实验。转染分组:miR-660-3p过表达组(转染miR-NC和miR-660-3p);miR-660-3p抑制组(转染anti-miR-NC和anti-miR-660-3p);miR-660-3p和REG4同时过表达组(转染miR-660-3p+pcDNA3.1和miR-660-3p+)及双荧光素酶报告系统组(转染WT-REG4+miR-NC,WT- REG4+miR-660-3p,MUT-REG4+miR-NC和MUT-REG4+miR-660-3p) qRT-PCR检测miR-660-3p的表达 用TRIzol试剂提取胃癌组织、癌旁组织及MGC-803细胞总RNA,然后以RNA为模板根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA,测定浓度和纯度,以cDNA为模板,按照 real-time PCR试剂盒的说明书进行反应,扩增miR-660-3p。反应程序为:95 ℃ 2 min;94 ℃ 40 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s,35个循环;72 ℃ 10 min。运用2-ΔΔCt方法进行数据分析 MTT实验检测细胞增殖 将转染后的MGC-803细胞接种于96孔板中(2×103个/孔),继续培养,分别在24 h、48 h和72 h时每孔加入 20 μL(5 mg/mL)MTT溶液,培养4 h后弃培养上清,加入150 μL DMSO,室温振荡5 min溶解甲臜结晶,酶标仪检测波长490 nm处吸光度?Transwell实验检测细胞迁移和侵袭(1)迁移实验:将MGC-803细胞在含10 g/L BSA的无血清RPMI-1640培养基中饥饿培养过夜,然后稀释为2×105个细胞/mL。取100 μL稀释的MGC-803细胞加入Transwell上层小室,Transwell下层小室加入500 μL含10%FBS的培养基作为迁移趋化物,置培养箱培养24 h,取出小室后用棉签拭去上层小室未迁移的细胞,甲醇固定迁移细胞,结晶紫染色,显微镜计数5~10个视野,取平均值。(2)侵袭实验:将事先液化的Matrigel用4 ℃无血清RPMI-1640培养基1∶6比例稀释,取100 μL加入上层Transwell小室,37 ℃使其固化,以下步骤同迁移实验 双荧光素酶报告实验 根据方法1.2.2进行MGC-803细胞培养和转染,分别将构建的REG4的野生型(WT-REG4)和突变型(MUT-REG4)双荧光素酶报告载体与miR-NC或miR-660-3p共转染MGC-803细胞,转染48 h后收集细胞,将细胞裂解,离心收集上清,发光仪检测上清中的荧光素活性。以海肾荧光素酶活性为内参照,计算相对萤火虫荧光素酶活性 Western blot检测蛋白表达 离心收集各组MGC-803细胞,室温裂解细胞并超声破碎,收集蛋白质,检测浓度后进行SDS-PAGE,转PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,洗涤,加入稀释的一抗(抗REG4抗体 1∶1 000、抗CyclinD1抗体1∶3 000、抗p21抗体1∶2 000、抗E-cadherin抗体1∶2 000、抗MMP-2抗体1∶3 000和抗GAPDH抗体1∶4 000),4 ℃过夜孵育,然后用PBST洗3次,加入稀释的HRP标记二抗,室温孵育2 h,洗涤2次,显影,分析蛋白水平,以GAPDH为内参照 统计学方法数据采用 SPSS 17.0统计软件进行处理。正态分布计量资料以表示,组间比较采用独立样本t检验或单因素方差进行分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1 miR-660-3p在胃癌组织和癌旁组织中的表达结果表明,与正常癌旁组织组相比,胃癌组织组的miR-660-3p表达量显著降低(P<0.05),见表1。表1miR-660-3p在胃癌组织和癌旁组织中的表达分组样本数miR-660-3p癌旁组织1340.胃癌组织1340.值- 91.246P值-0.0002.2 过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖的影响结果表明,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p组的miR-660-3p表达量显著升高(P<0.05),增殖相关蛋白Cyclin D1表达降低(P<0.05),增殖负调控蛋白p21显著上调(P<0.05),细胞OD490 nm在24 h、48 h和72 h均显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05),见图1和表2。说明过表达miR-660-3p可抑制MGC-803细胞增殖。图1过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖蛋白表达的影响表2过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖的影响分组miR-660-3pCyclin D1蛋白P21蛋白细胞活性(OD 490 nm)24 h48 h72 hmiR-NC0.-660-3p0.值18...9274..值2.3 过表达miR-660-3p可抑制胃癌细胞MGC-803迁移和侵袭结果显示,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p组的MGC-803细胞中跨膜蛋白E-cadherin表达量显著上升(P<0.05),MPP-2表达量显著下降(P<0.05),迁移和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05),见图2和表3。说明抑制miR-660-3p可抑制MGC-803细胞迁移和侵袭。图2过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803迁移、侵袭蛋白表达的影响表3过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803迁移、侵袭的影响分组E-cadherin蛋白MMP-2蛋白迁移细胞数侵袭细胞数miR-NC0.-660-3p0.值.值2.4 miR-660-3p靶向调控REG4Targetscan预测结果显示,REG4的3′UTR含有与miR-660-3p互补的核苷酸序列,见图3A。双荧光素酶报告实验结果如表4所示,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p可使野生型WT-REG4的荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05);而突变型MUT-REG4的荧光素酶相对活性没有明显变化。Western blot结果表明,过表达miR-660-3p组的REG4 蛋白表达量显著降低(P<0.05);抑制miR-660-3p表达组的REG4 表达量显著升高(P<0.05),见图3B和表5。说明miR-660-3p靶向负调控REG4的表达。图3miR-660-3p靶向调控REG4 A:REG4的3′UTR含有miR-660-3p的互补序列;B:miR-660-3p调控REG4的表达表4双荧光素酶报告实验分组WT- REG4MUT- REG4miR-NC0.-660-3p0.值18.598 0.346P值表5miR-660-3p调控REG4的表达分组REG4蛋白miR-NC0.-660-3p0.-miR-NC0.- miR-660-3p1.值264.508P值0.000注:与miR-NC组比较,aP<0.05;与anti-miR-NC组比较,bP<0.052.5 过表达REG4可逆转过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖、迁移和侵袭的作用结果(图4、表6和表7)所示,与miR-NC组相比,过表达miR-660-3p组的结果与结果2.2和2.3一致,过表达miR-660-3p抑制MGC-803中REG4表达(P<0.05),抑制细胞增殖、迁移和侵袭;与miR-660-3p+pcDNA3.1组相比,同时过表达miR-660-3p和REG4组MGC-803中REG4表达量升高(P<0.05),Cyclin D1和E-cadherin表达量上升(P<0.05),p21和MPP-2表达降低(P<0.05),细胞OD490nm显著升高(P<0.05),迁移和侵袭细胞数均显著增多(P<0.05),差异均具有统计学意义。说明过表达REG4可逆转过表达miR-660-3p对MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。图4过表达REG4表达可逆转过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响表6过表达REG4表达可逆转过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803增殖的作用分组Cyclin D1蛋白P21蛋白细胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 hmiR-NC0.-660-3p0.-660-3p+-660-3p+ REG40.值214.....474P值0.000注:与miR-NC组比较,aP<0.05;与miR-660-3p+pcDNA3.1组比较,bP<0.05表7过表达REG4表达可逆转过表达miR-660-3p对胃癌细胞MGC-803迁移和侵袭的作用分组REG4蛋白E-cadherin蛋白MMP-2蛋白迁移细胞数侵袭细胞数miR-NC0.-660-3p0.-660-3p+-660-3p+ REG40.值203.....372P值0.000注:与miR-NC组比较,aP<0.05;与miR-660-3p+pcDNA3.1组比较,bP<0.053讨论根据2015年中国癌症统计结果,我国胃癌死亡率仅次于肺癌,位居肿瘤死亡率第二位[8]。癌症转移是患者死亡主要原因,研究胃癌转移机制是基础研究的热点。多种miRNA(micro RNA)通过PI3K/AKT、Wnt/β-Catenin/Tcf、Ras/Raf/MEK/ERK、p53及TGF-β等信号通路参与胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭及药物敏感性等生物学功能[9]。miR-660-5p在乳腺癌中表达上调,是其潜在预后标志物,与患者的总生存率有关[10]。miR-660在肺癌患者中被显著下调,过度表达miR-660可减少迁移、侵袭和增殖并增加凋亡[11],miR-660-5p通过miR-660-MDM2-p53途径正调控miR-486-5p,进而影响肺癌的发生[12],通过靶向KLF9来控制非小细胞肺癌(NSCLC)的增殖、存活和转移[13]。在胃癌组织和细胞系中,miR-660显著降低,其低表达与肿瘤体积、淋巴结转移、晚期肿瘤坏死机制和不良预后密切相关,过表达miR-660可靶向癌基因E2F3(E2F转录因子3)抑制胃癌MGC-803和AGS细胞增殖病诱导细胞凋亡[14]。本研究发现,miR-660-3p在胃癌组织中表达显著降低,过表达miR-660-3p可以抑制胃癌MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭,与He等[14]的结果一致,说明miR-660-3p在胃癌的进展中发挥重要作用。本研究通过Targetscan预测发现,REG4的3′UTR含有与miR-660-3p互补的核苷酸序列,提示REG4可能是miR-660-3p的靶基因。REG4是再生基因家族成员之一,在多种肿瘤中表达上调,参与胃肠道细胞增生与分化,与胃肠道肿瘤的发生、转移及不良预后有关[15-16]。REG4在胃癌中表达上调,通过AKT途径促进胃癌细胞的增殖和迁移[17],通过GPR37促进胃癌腹膜转移[18],其还通过激活MAPK/ERK/BIM信号通路增强胃癌对5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐药性[19]。最新研究显示,REG4单链抗体(scFv-Reg4)能显著抑制胃癌细胞增殖,协同增强5-FU的癌细胞杀伤作用[20],表明REG4对胃癌的发展、转移、耐药性及治疗等具有重要作用。本研究发现,REG4在胃癌组织中表达上调,与Huang等[17]结果一致。双荧光素酶报告系统实验和Western blot发现,miR-660-3p靶向负调控REG4的表达,过表达REG4可逆转过表达miR-660-3p对MGC-803细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,说明在胃癌中miR-660-3p靶向REG4调控胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,证实了研究之初的假设。综上,在胃癌MGC-803细胞中,miR-660-3p表达下调,REG4表达上调,miR-660-3p可靶向REG4调控胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-660-3p和REG4是胃癌的潜在分子靶点。参考文献[1] 左婷婷, 郑荣寿, 曾红梅,等. 中国胃癌流行病学现状[J]. 中国肿瘤临床, 2017,44(1):52-58.[2] Song Z, Wu Y, Yang J, et al. 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文章来源:《中国微侵袭神经外科杂志》 网址: http://www.zgwqxsjwkzz.cn/qikandaodu/2020/1112/359.html
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