逆转录病毒介导抑制基因对人肝癌细胞血管生成(2)
实验分组同1.4。转染后提取蛋白,采用0.1%SDS-10%PAGE电泳后转至硝酸纤维素膜(NC膜),以含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h。加入一抗(Mig-7,1∶200;β-actin,1∶500),4℃过夜;TBST洗膜。再加入以牛奶封闭的HRP标记二抗(抗兔,1∶1000;抗鼠,1∶1000),室温下孵育2 h,TBST洗膜。化学发光(ECL)试剂盒显影。
1.6 三维细胞培养
实验分组同1.4。在6孔板中加入50 μL Matrigel,室温下静置20 min,37℃静置30 min,待Matrigel凝固后,分别加入100 μL以上6组细胞完全培养液,细胞浓度为1×106/mL。再加入完全培养液2 mL,37℃、5% CO2培养箱中培养。
1.7 转染后对MHCC-97H细胞间粘附、侵袭、迁移能力的影响
1.7.1 细胞间粘附能力检测 实验分组同1.4。制备单细胞悬液,调整浓度为1×106/mL。将1 mL细胞悬液放入1.5 mL的EP管中,每组细胞各5管。37℃培养箱中孵育12 h,分别于2、6、12 h进行细胞计数1次。以剩余单个细胞占总细胞数的百分比作为细胞粘附能力评价指标,比例越低,粘附的细胞越多,其细胞-细胞间粘附能力就越强。
1.7.2 Transwell侵袭实验检测 实验分组同1.4。将Transwell置于24孔培养板中,Matrigel 10 μg/孔,37℃静置4 h,待胶凝固。细胞消化,调整细胞浓度至1×105/ mL。吸取400μL细胞悬液加入到Transwell的上室,Transwell的下室加入10%FBS的DMEM培养基。37℃,5%CO2孵箱培养20 h。甲醇固定,结晶紫染色。普通光学显微镜下观察处于微孔滤膜外侧面上的细胞,镜下计数迁移到滤膜下表面的细胞数,随机计数5个视野的细胞数目。
1.7.3 迁移实验检测 实验分组同1.4。转染后消化细胞,每孔加入100 μL细胞悬液,使每孔内细胞数约为1.0×105,下腔室中加入含有20%FBS的完全培养基。37℃培养箱中孵育24 h。取出小室,以棉签小心擦除滤膜上室面的细胞,以甲醇固定黏附在下室面的细胞,结晶紫染色。观察计数方法同1.7.2。
图1 逆转录病毒稳定高效地感染MHCC-97H细胞Fig.1 Effective and stable retrovirus infection of MHCC-97H cells(Original magnification:×400).A:Mig-7 shRNA-1 group(light microscope);B:Mig-7 shRNA-2 group(light microscope);C:Mig-7 shRNA-N group(light microscope);D:Vector group(light microscope);E:Mig-7 shRNA-1 group(fluorescence microscope);F:Mig-7 shRNA-2 group(fluorescence microscope);G:Mig-7 shRNA-N group (fluorescence microscope);H:Vector group(fluorescence microscope).
1.8 统计方法
全部数据经SPSS20.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析并行两两比较,以P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 逆转录病毒高效转染MHCC-97H细胞
本研究采用的逆转录病毒载体系统携带绿色荧光蛋白,因此可以在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达(图1)。Mig-7 shRNA-1组、Mig-7 shRNA-2组、Mig-7 shRNA-N组及空载体质粒组(Vector)镜下均可见稳定转染的绿色荧光蛋白标记阳性的细胞90%以上,这表明本实验所采用的逆转录病毒载体系统可高效、稳定地感染MHCC-97H细胞。
2.2 Mig-7shRNA抑制MHCC-97H细胞Mig-7 mRNA和Mig-7蛋白表达
半定量PCR(图2A,B)显示:Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组的Mig-7mRNA水平都明显下降,Mig-7 shRNA-1组最为明显。Western blotting结果(图2C)表明:Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组的Mig-7蛋白水平均明显下降,Mig-7 shRNA-1组最为明显。结果说明构建的Mig-7shRNA能够有效地抑制Mig-7 mRNA及Mig-7蛋白的表达。
2.3 Mig-7shRNA抑制MHCC-97H细胞VM形成能力
三维细胞培养(图3)显示:Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组细胞粘附成团,不能形成VM;Mig-7 shRNA-N组VM形成与转染空载体质粒组(Vector)、ES处理组、MHCC-97H细胞对照组无明显差别。结果说明:Mig-7干扰后MHCC-97H细胞形成VM的能力受到明显抑制。
图2 转染后各组MHCC-97H细胞Mig-7 mRNA的表达Fig.2 Expression of Mig-7 mRNA(A,B)and protein(C) in MHCC-97H cells after transfection.*P<0.05 vs Mig-7 shRNA-2,Mig-7 shRNA-N,vector,ES and control groups;#P<0.05 vs Mig-7 shRNA-N,vector,ES and control groups.
图3 各组转染后对MHCC-97H细胞形成VM能力的影响Fig.3 VM formation in MHCC-97H cells after :Mig-7 shRNA-1;B:Mig-7 shRNA-2;C:Mig-7 shRNA-N;D: Vector,E:ES,F:Control.
2.4 Mig-7shRNA对MHCC-97H细胞间粘附能力的影响
结果(图4)显示:Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组MHCC-97H细胞粘附能力明显强于其余各组MHCC-97H细胞(P<0.05);Mig-7 shRNA-1组较Mig-7 shRNA-2组细胞粘附能力强(P<0.05);其余4组间相比MHCC-97H细胞粘附能力无差异(P>0.05)。这表明下调Mig-7表达可增加MHCC-97H细胞粘附能力。
文章来源:《中国微侵袭神经外科杂志》 网址: http://www.zgwqxsjwkzz.cn/qikandaodu/2021/0518/661.html